Ehrlichia risticii

Systématique La fièvre équine du Potomac a été identifiée pour la première fois en 1979 lors d'une épizootie observée dans une région proche de la rivière Potomac (comté de Montgomery, Maryland, USA). Dès 1983, le caractère infectieux et transmissible de la maladie a été établi car l'injection intraveineuse de sang, prélevé sur des chevaux malades, reproduit la maladie chez des animaux sains. Par la suite, des examens microscopiques ont révélé la présence de morulas dans les monocytes des chevaux infectés et le rôle d'une rickettsie a été suspecté. En utilisant une culture de monocytes équins, Holland et Ristic isolent une souche bactérienne évoquant une Ehrlichia sp. et ces auteurs montrent 1) que cette souche est apte à reproduire l'infection chez un poney et 2) que le sang de cet animal permet d'isoler à nouveau la souche. En dépit de communautés antigéniques avec Ehrlichia canis et, surtout, avec Ehrlichia sennetsu, les études sérologiques révèlent l'existence d'une structure antigénique originale. Compte tenu de cette structure antigénique, Holland et al. (1985) proposent la nomenclature de Ehrlichia risticii pour cette bactérie. L'étude de la séquence des ARNr 16S permet de placer Ehrlichia risticii dans le groupe génomique III de la tribu des Ehrlichieae* (voir tableau I) et, au sein de ce groupe, Ehrlichia risticii apparaît phylogénétiquement proche de l'agent SF** (l'ARNr 16S de la souche type de Ehrlichia risticii présente 99 p. cent d'homologie de séquence avec l'ARNr 16S de l'agent SF). Il est intéressant de remarquer que les autres espèces du groupe III (l'agent SF, Ehrlichia sennetsu et Neorickettsia helminthoeca) sont transmises aux vertébrés par l'intermédiaire de trématodes et que ce mode de contamination apparaît très probable pour Ehrlichia risticii (Cf. infra). L'étude des séquences de l'ARNr 16S et du gène codant pour une protéine de 51 kDa, montrent que les souches de Ehrlichia risticii sont hétérogènes et peuvent se répartir en trois groupes : Ehrlichia risticii sensu stricto, Ehrlichia risticii-like groupe Kentucky et Ehrlichia risticii-like groupe Ohio 081. Au vu de ces résultats, Wen et al. estiment nécessaire la création de deux nouvelles espèces pour accueillir les souches des groupes Kentucky et Ohio 081 mais ces auteurs ne proposent aucune nomenclature. Caractères bactériologiques Les caractères bactériologiques de Ehrlichia risticii sont ceux du genre Ehrlichia. Sur le plan phénotypique, les Ehrlichia sp. sont des micro-organismes généralement de forme arrondie, présentant un tropisme pour diverses cellules mais jamais pour les globules rouges et doués d’un pouvoir pathogène pour certains mammifères dont l'homme. Ce sont des bactéries à Gram négatif, colorées en pourpre par le May-Grümwald-Giemsa, immobiles, non cultivables sur milieux inertes, non cultivables sur œufs embryonnés, parasites intracellulaires obligatoires et se multipliant dans le cytoplasme des cellules infectées. Les Ehrlichia sp. pénètrent dans les cellules par phagocytose, elles inhibent la fusion phagosomes-lysozomes et se multiplient dans les phagosomes. Cette multiplication conduit à l'apparition d'inclusions denses, appelées "morulas", pouvant contenir plus de 100 bactéries. Des études de microscopie électronique révèlent des éléments hétérogènes en taille et en densité ce qui montre l'existence d'un véritable cycle de développement voisin de celui des bactéries de l'ordre des Chlamydiales : corps infectants capables de traverser des filtres de porosité 0,45 µm, corps élémentaires denses de 0,2 à 0,5 µm et corps réticulés de 0,4 à 1,2 µm de diamètre qui se regroupent dans la morula. Le genre Ehrlichia diffère cependant des espèces de la famille des Chlamydiaceae par ses caractères génétiques, antigéniques (absence de réactivité croisée en immunofluorescence indirecte) et métaboliques (les Ehrlichia sp. sont aptes à oxyder la L-glutamine et à générer de l’ATP). Ehrlichia risticii se présente sous la forme de bactéries polymorphes (rondes, ovales ou allongées), de 0,4 à 0,75 µm de diamètre sur 0,5 à 1,2 µm de longueur, présentes dans des morulas mais pouvant aussi se trouver sous forme isolée dans le cytoplasme. La culture peut être obtenue sur des cultures primaires de monocytes de chevaux et de chiens ou en utilisant les lignées P388D1 et MDH-SP constituées de macrophages murins ou en utilisant des cellules T-34 (cellules épithéliales de l'intestin d'origine humaine). Le milieu de culture (199 ou RPMI 1640 contenant de la L-glutamine) doit être enrichi de 20 p. cent de sérum de veau fœtal et la température optimale de croissance, dans une atmosphère normale ou contenant 5 p. cent de dioxyde de carbone, est de 37 à 38 °C. In vivo, la bactérie se multiplie dans les monocytes, les macrophages et dans les cellules de l’intestin et notamment les cellules du côlon. L'analyse de plusieurs souches révèle une variabilité antigénique importante. Deux souches, la souche 25-D isolée en 1984 et la souche 90-12 isolée en 1990 d'un cheval vacciné, ont fait l'objet de nombreux travaux. Une différence majeure entre ces deux souches concerne des antigènes de surface qui semblent jouer un rôle important pour susciter la synthèse d'anticorps protecteurs. La souche 25-D possède un antigène de 50 kDa mais elle est dépourvue d'un antigène de 85 kDa alors que des résultats inverses sont obtenus avec la souche 90-12. Des souris immunisées avec la souche 25-D ou avec la protéine de 50 kDa sont protégées vis-à-vis de la souche homologue mais pas vis-à-vis de la souche 90-12. Par contre, des souris immunisées avec la souche 90-12 ou avec la protéine de 85 kDa sont protégées vis-à-vis des deux souches. Les souches vaccinales, actuellement utilisées aux USA, sont des souches proches de la souche 25-D ce qui pourrait expliquer les nombreux échecs de vaccination observés sur le terrain (Cf. infra). Habitat et pouvoir pathogène Ehrlichia risticii provoque une maladie du cheval connue sous les noms de "fièvre équine du Potomac" (du nom d’une rivière du Maryland) ou de "ehrlichiose monocytique équine". L'affection a été identifiée aux USA, au Canada et elle existe probablement dans de nombreux pays d'Europe. En France, son existence a été fortement suspectée à partir d'une observation clinique concordante, accompagnée d'une sérologie positive. Le nombre d’infections inapparentes est important mais, lorsque la maladie a une expression clinique, celle-ci est très différente de l’ehrlichiose à Ehrlichia equi. Les chevaux atteints présentent de la fièvre (39,4 à 41,1 °C), de l'asthénie, de l'anorexie, une congestion des muqueuses, des œdèmes des membres, une fourbure parfois sévère (observée dans 40 p. cent des cas), une typhlocolite et une diarrhée pouvant être soit modérée et transitoire soit sévère et conduisant à une déshydratation. Le taux de mortalité peut atteindre 30 p. cent chez les individus malades. Ehrlichia risticii est certainement une cause d’avortement car l’isolement de cette bactérie a été effectué chez des avortons de juments infectées et, expérimentalement, l'infection de juments gravides provoque des avortements et le germe est isolé des avortons. En utilisant des tests d'immunofluorescence indirecte, des anticorps anti-Ehrlichia risticii ont été mis en évidence chez le chat, le chien, le porc et la chèvre et, expérimentalement, le chien, le chat et la souris sont sensibles à l'infection. A la suite d'une inoculation expérimentale, le chien ne développe pratiquement aucun signe clinique et le chat peut, éventuellement, présenter soit une diarrhée intermittente soit une adénopathie généralisée accompagnée d'anorexie et d'abattement. Il semble donc peu probable que ces espèces constituent un réservoir de germes. Dans une étude effectuée par Kakoma et al. et portant sur environ 2000 animaux atteints d'une ehrlichiose évoquant une infection à Ehrlichia canis, 100 chiens présentaient une sérologie positive vis-à-vis de Ehrlichia risticii (titres compris entre 10 et 640) alors que la réponse était négative vis-à-vis de Ehrlichia canis ou de Ehrlichia sennetsu. Des souches de Ehrlichia sp. ont pu être isolées à partir de trois animaux. Ces souches ne peuvent être distinguées de Ehrlichia risticii ni par leurs caractères morphologiques ou structuraux ni par la séquence de leurs ARNr 16S. Compte tenu de l'origine de ces souches, les auteurs suggèrent que l'agent de ces infections soit placé dans une sous-espèce de Ehrlichia risticii qu'ils appellent "Ehrlichia risticii subsp. atypicalis" (nomenclature non validement publiée). Les infections du chien à "Ehrlichia risticii subsp. atypicalis" n'ont été décrites qu'aux Etats Unis d'Amérique où leur existence rend nécessaire la réalisation d'un dosage d'anticorps anti-Ehrlichia risticii lorsqu'un animal atteint d'une ehrlichiose (évoquant une ehrlichiose à Ehrlichia canis) est dépourvu d'anticorps anti-Ehrlichia canis. La nature des vecteurs ainsi que les modes de contamination sont restés longtemps mystérieux et il a fallu attendre 1998 pour que les premiers résultats probants soient publiés. Par analogie avec d’autres ehrlichioses on avait incriminé des tiques et des insectes mais, les essais de transmission par Dermacentor variabilis, Rhipicephalus sanguineus, Ixodes scapularis, Amblyomma americanum, Ctenocephaloides felis, Stomoxys calcitrans ou des tabanidés n'ont pas été couronnés de succès. Une contamination par voie orale semble plus probable car l’infection est expérimentalement transmissible par ingestion de bactéries et les chevaux infectés excrètent le germe dans leurs fèces. La coprophagie étant peu répandue chez le cheval, l'ingestion de fèces contaminées ne semble pas jouer un rôle important dans la transmission de la maladie. Toutefois, une contamination par voie orale pourrait résulter de l'ingestion de trématodes infectés, mode de contamination bien connu pour Ehrlichia sennetsu, pour Neorickettsia helminthoeca et pour l'agent SF. Cette hypothèse repose sur les arguments suivants : . Des séquences d'ADN spécifiques de Ehrlichia risticii ont été mises en évidence chez des escargots d'eau douce du genre Juga (certainement Juga hemphilli hemphilli) et du genre Stagnicola prélevés dans une zone d'endémie de fièvre équine du Potomac. Ultérieurement, Reubel et al. ont suggéré que les séquences d'ADN étaient présentes dans des cercaires éliminées par les escargots. . Des séquences d'ADN spécifiques de Ehrlichia risticii ont été identifiées dans des cercaires infestant un autre escargot d'eau douce (Elimia livescens) et l'inoculation intrapéritonéale de souris, avec un broyat de cercaires, conduit à une infection des animaux. . Pusterla et al. (2000) ont montré que l'inoculation de chevaux par voie sous-cutanée, à l'aide de sporocystes et de cercaires prélevées sur Juga yrekaensis, conduisait à une infection des animaux. Les chevaux présentent des signes cliniques compatibles avec ceux de la fièvre équine du Potomac et Ehrlichia risticii peut être isolée du sang des animaux. . Les mollusques des genres Juga et Elimia appartiennent à une famille qui inclut également Oxytrema silicula, espèce connue comme étant un hôte intermédiaire du trématode Nanophyetus salmincola qui constitue le réservoir et le vecteur de Neorickettsia helminthoeca. . Des escargots d'eau douce sont souvent présents en grand nombre dans l'environnement des chevaux atteint de fièvre du Potomac et, dans certaines zones de la Californie ou de l'Oregon, jusqu'à 10,5 p. cent d'entre eux hébergent des cercaires infectées par Ehrlichia risticii. L'hypothèse d'une contamination par l'intermédiaire de l'ingestion de trématodes semble donc probable. Pour affiner les connaissances épidémiologiques et pour mettre en œuvre des moyens de lutte, il est nécessaire de dresser l'inventaire des espèces de trématodes*** jouant le rôle de vecteurs et l'inventaire des espèces d'escargots*** aptes à héberger les cercaires des ces parasites. Il convient de remarquer que tous les travaux évoqués ci-dessus ont été effectués aux USA et que, à la connaissance de l'auteur, aucune étude similaire n'a été réalisée sur des escargots européens ou sur leurs parasites. Diagnostic L’isolement du germe en cultures cellulaires est une technique réservée aux travaux de recherche et elle n’est pas utilisée dans le cadre d’un diagnostic de routine. La mise en évidence des morulas dans le cytoplasme des cellules sanguines (coloration de Giemsa), même après leucoconcentration, donne des résultats décevants car la présence des morulas est temporaire et leur nombre est toujours faible. Eventuellement, il est possible de visualiser l’agent pathogène sur des biopsies de côlon. Le diagnostic sérologique, utilisant des antigènes produits en culture cellulaire, reste la méthode la plus utilisée. Les chevaux infectés présentent une ascension très rapide du titre en anticorps spécifiques et les anticorps peuvent être décelés avant même l'apparition des signes cliniques. Le pic est atteint en quelques jours puis les anticorps se maintiennent en plateau durant une période prolongée (des titres égaux ou supérieurs à 2560 persistent fréquemment durant plus d'un an). L'analyse d'un unique sérum n'a donc aucun intérêt pour le diagnostic et il est nécessaire de disposer d'un sérum précoce (prélevé dans toutes premières heures de la maladie) et d'un sérum tardif afin de mettre en évidence une séroconversion. Dans certains cas, le sérum précoce présente déjà un titre élevé ne permettant pas de caractériser une séroconversion. L'antibiothérapie, même précoce, ne semble pas avoir une influence majeure sur la cinétique des anticorps et le sérodiagnostic est réalisable sur des animaux traités. Les animaux vaccinés peuvent présenter des titres atteignant 640 mais, lorsqu'ils sont infectés les titres atteignent des valeurs considérables souvent supérieures à 100 000. La détection des anticorps anti-Ehrlichia risticii se réalise par immunofluorescence indirecte, par immuno-enzymologie ou par western blot. En dépit de l'existence de faux positifs, l'immunofluorescence indirecte reste le test le plus utilisé. L'analyse sérologique devra être effectuée par un laboratoire expérimenté et des sérums de référence (sérum négatif et sérum positif) doivent être obligatoirement testés lors de chacune des analyses. D’autres techniques sont utilisées pour le diagnostic des infections à Ehrlichia risticii : . L’utilisation d’une sonde d’ADN de 1 kilobase, marquée au 32P, est capable de détecter Ehrlichia risticii dès la période d’incubation et jusqu’au 25ème jour. Cette sonde est spécifique et ne donne pas de réactions croisées avec Ehrlichia canis, Ehrlichia equi ou Ehrlichia sennetsu. . Des techniques d’amplification en chaîne (PCR) ont été proposées. Parmi celles ci, les techniques de PCR emboîtée ou de PCR quantitative en temps réel (TaqMan PCR), apparaissent sensibles, spécifiques et capables de mettre en évidence toutes les souches y compris celles des groupes Kentucky et Ohio 081. . Des techniques immuno-enzymatiques, utilisant des anticorps monoclonaux et destinées à mettre en évidence une antigénémie, sont trop peu sensibles pour une utilisation dans le cadre d'un diagnostic. Sensibilité aux antibiotiques et prophylaxie In vitro, la croissance de Ehrlichia risticii est fortement inhibée par de faibles doses de tétracycline, d'oxytétracycline, de doxycycline, de minocycline, de pénicilline G, de streptomycine ou de gentamicine. Le traitement fait généralement appel à l'oxytétracycline administrée une fois par jour, par voie intraveineuse, à la dose de 6,6 mg par kilo. La durée du traitement ne doit pas excéder cinq jours et les rechutes sont très rares. La réponse au traitement est extrêmement rapide et, dans les 12 heures, l'état de l'animal s'améliore sensiblement. L'efficacité du traitement est telle qu'une absence d'amélioration de l'état clinique dans les 24 heures suivant une administration d'oxytétracycline doit faire soupçonner une erreur de diagnostic. L'oxytétracycline peut être remplacée par une association érythromycine - rifampicine. Dans ce cas, l'amélioration clinique n'intervient que 24 heures plus tard mais la durée du traitement est plus courte (en moyenne, trois jours). Pour prévenir les infections à Ehrlichia risticii, des vaccins inactivés et adjuvés sont disponibles aux USA (deux injections à trois semaines d’intervalle suivies d’un rappel quatre mois plus tard et d’un ou deux rappels annuels). La vaccination est loin de conférer une protection absolue (lors d'une étude effectuée en Virginie et dans le Maryland et portant sur 43 cas de fièvre équine du Potomac, 38 cas ont été observés sur des chevaux vaccinés !) mais elle est capable d'atténuer la sévérité des signes cliniques. Les échecs de vaccination semblent liés à l'hétérogénéité des souches de Ehrlichia risticii (Cf. supra) et à l'absence de production d'anticorps dirigés contre les antigènes de surface. Ces derniers semblent en effet être altérés lors de l'inactivation des souches vaccinales par le formol. 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Les études comparatives des séquences de l'ADN codant pour les ARNr 16S montrent : 1) qu'il est possible de séparer la tribu des Ehrlichieae en quatre groupes génomiques (voir tableau I) ; 2) que Anaplasma marginale et Anaplasma ovis (bactéries autrefois classées dans l'ordre des Rickettsiales, famille des Anaplasmataceae) appartiennent au groupe génomique II ; 3) que les espèces du genre Wolbachia (bactéries autrefois placées dans l'ordre des Rickettsiales, famille des Rickettsiaceae, tribu des Wolbachieae) appartiennent au groupe génomique IV. La souche bactérienne préalablement connue sous le nom d'agent WSU 86-1044, rapprochée de la tribu des Ehrlichieae sur la base de communautés antigéniques avec Cowdria ruminantium, est en fait une espèce de l'ordre des Chlamydiales qui a été placée dans le nouveau genre Waddlia avec la nomenclature de Waddlia chondrophila. La tribu des Ehrlichieae est parfois exclue de la famille des Rickettsiaceae. Toutefois, elle en reste très proche si bien que la plupart des auteurs incluent encore cette tribu dans les Rickettsiaceae (voir annexe 1). Sur le plan phénotypique, à l'exception des espèces des genres Anaplasma et Wolbachia, la tribu des Ehrlichieae rassemble des micro-organismes généralement de forme arrondie, présentant un tropisme pour diverses cellules mais jamais pour les globules rouges et doués d’un pouvoir pathogène pour certains mammifères dont l'homme. Ce sont des bactéries à Gram négatif, colorées en pourpre par le May-Grümwald-Giemsa, immobiles, non cultivables sur milieux inertes, non cultivables sur œufs embryonnés, parasites intracellulaires obligatoires et se multipliant dans le cytoplasme des cellules infectées. Les représentants de la tribu des Ehrlichieae se transmettent aux hôtes vertébrés par des vecteurs : helminthes ou arthropodes (voir tableau I). Au sein d'un même groupe génomique, il existe de fortes réactivités antigéniques croisées alors que les réactions sérologiques croisées sont plus faibles entre espèces appartenant à des groupes génomiques différents. Dans le genre Ehrlichia, huit espèces ont un statut dans la nomenclature : Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia muris, Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia risticii et Ehrlichia sennetsu. En revanche, huit espèces sont considérées comme incertae sedis par le Bergey's Manual of Systematic Bacteriology : "Cytoecetes ovis var. decani", "Ehrlichia bovis", "Ehrlichia kurlovi", "Ehrlichia ("Cytoecetes") microti", "Ehrlichia ondiri", "Ehrlichia ovina", "Ehrlichia platys", "Rickettsia ("Donatienella") delpyi" et "Rickettsia belgaumi". Plusieurs espèces, dont l'agent de l'ehrlichiose granulocytique humaine, n'ont pas encore reçu de noms. Retour ** : L'agent SF L'agent SF a été isolé en 1962 de métacercaires de Stellantchasmus falcatus parasitant un mulet cabot (Mugil cephalus). Les caractères morphologiques et biologiques ainsi que les analyses antigéniques ont permis de placer cette bactérie dans la tribu des Ehrlichieae. L'analyse des séquences des ARNr 16S révèle une parenté phylogénétique avec Ehrlichia risticii, Ehrlichia sennetsu et, dans une moindre mesure, avec Neorickettsia helminthoeca. Expérimentalement, l'agent SF provoque une splénomégalie sévère et une adénopathie généralisée chez la souris ainsi qu'une fièvre modérée chez le chien. Son pouvoir pathogène naturel est inconnu. Retour *** : Parmi les trématodes susceptibles de servir de vecteur, Barlough et al. mentionnent Acanthatrium oregonense dont les hôtes définitifs sont des chauves-souris. Pour ces mêmes auteurs, outre les escargots des genres Elimia, Juga et Stagnicola, les espèces des genres Pleurocera, Lithasia et Gyrotoma pourraient jouer un rôle. Retour